Die Struktur des Arabidopsis-Phytochroms A zeigt eine topologische und funktionelle Diversifizierung zwischen den pflanzlichen Photorezeptor-Isoformen

Naturpflanzen (2023)Diesen Artikel zitieren

3 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Pflanzen nutzen eine divergente Kohorte von Phytochrom (Phy)-Photorezeptoren, um viele Aspekte der Morphogenese durch reversible Photoumwandlung zwischen inaktiven Pr- und aktiven Pfr-Konformeren zu steuern. Die beiden einflussreichsten sind PhyA, deren Beibehaltung von Pfr die Wahrnehmung von schwachem Licht ermöglicht, während die relative Instabilität von Pfr für PhyB es besser für die Erkennung von voller Sonne und Temperatur geeignet macht. Um diese Kontraste besser zu verstehen, haben wir mittels Kryo-Elektronenmikroskopie die dreidimensionale Struktur von PhyA in voller Länge als Pr gelöst. Wie PhyB dimerisiert PhyA durch Kopf-an-Kopf-Anordnung seiner C-terminalen Histidinkinase-bezogenen Domänen (HKRDs), während sich der Rest als Kopf-an-Schwanz-Licht-responsive Plattform zusammensetzt. Während die Plattform und die HKRDs in PhyB-Dimeren asymmetrisch assoziieren, fehlen diese einseitigen Verbindungen in PhyA. Die Analyse von Verkürzungen und ortsspezifischen Mutanten ergab, dass diese Entkopplung und der veränderte Plattformaufbau funktionelle Konsequenzen für die Pfr-Stabilität von PhyA haben und verdeutlicht, wie die strukturelle Diversifizierung pflanzlicher Phy die Licht- und Temperaturwahrnehmung erweitert hat.

Dies ist eine Vorschau der Abonnementinhalte, Zugriff über Ihre Institution

Greifen Sie auf Nature und 54 weitere Nature Portfolio-Zeitschriften zu

Holen Sie sich Nature+, unser preisgünstigstes Online-Zugangsabonnement

29,99 $ / 30 Tage

jederzeit kündigen

Abonnieren Sie diese Zeitschrift

Erhalten Sie 12 digitale Ausgaben und Online-Zugriff auf Artikel

119,00 $ pro Jahr

nur 9,92 $ pro Ausgabe

Leihen oder kaufen Sie diesen Artikel

Holen Sie sich diesen Artikel nur so lange, wie Sie ihn benötigen

39,95 $

Die Preise können örtlicher Steuern unterliegen, die beim Bezahlvorgang berechnet werden

Quelldaten für alle thermischen Umkehrdiagramme Pfr→Pr in den Abbildungen. 5–7 finden Sie in der Ergänzungstabelle 2. Bilder vollständiger SDS-PAGE-Gele finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. Die 3D-Kryo-EM-Konsensuskarte des Arabidopsis-PhyA-Dimers in voller Länge mit einer Auflösung von 3,2 Å wurde in der EMDB hinterlegt Datenbank unter dem Zugangscode EMD-28870. Die fokusverfeinerten Plattform- und HKRD-Karten mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,1 Å bzw. 3,4 Å wurden in der EMDB-Datenbank unter den Zugangscodes EMD-28871 und EMD-28872 hinterlegt. Die zusammengesetzte 3D-Karte wurde in der EMDB-Datenbank unter dem Zugangscode EMD-28869 hinterlegt, und das entsprechende Atommodell ist in der RCSB-Datenbank unter dem PDB-Code 8F5Z verfügbar. Diese Studie nutzte mehrere öffentlich verfügbare Proteinstrukturen für Phys- und Sender-Histidinkinasen, die aus der RCSB-Datenbank (http://www.rcsb.org) unter den Zugangscodes 2VEA, 6TC5, 6TC7, 6TL4, 4U7O und 7RZW bezogen wurden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Legris, M., Ince, YC & Fankhauser, C. Molekulare Mechanismen, die der Phytochrom-gesteuerten Morphogenese in Pflanzen zugrunde liegen. Nat. Komm. 10, 5219 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burgie, ES & Vierstra, RD Phytochrome: eine atomare Perspektive auf Photoaktivierung und Signalübertragung. Plant Cell 26, 4568–4583 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Franklin, KA & Quail, PH Phytochrome spielen bei der Entwicklung von Arabidopsis eine Rolle. J. Exp. Bot. 61, 11–24 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Legris, M. et al. Phytochrom B integriert Licht- und Temperatursignale in Arabidopsis. Science 354, 897–900 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jung, JH et al. Phytochrome fungieren in Arabidopsis als Thermosensoren. Wissenschaft 354, 886–889 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Burgie, ES et al. Unterschiedliche biophysikalische Eigenschaften untermauern die einzigartigen Signalpotentiale innerhalb der pflanzlichen Phytochromfamilien. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 118, e2105649118 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rockwell, NC & Lagarias, JC Phytochrom-Evolution in 3D: Löschung, Duplizierung und Diversifizierung. Neues Phytol. 225, 2283–2300 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Isaksson, L. et al. Signalmechanismus von Phytochromen in Lösung. Struktur 29, 151–160.e3 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Burgie, ES et al. Photoreversible Umwandlung eines photosensorischen Phytochrommoduls im kristallinen Zustand. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 300–307 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carrillo, M. et al. Hochaufgelöste Kristallstrukturen transienter Zwischenprodukte im Phytochrom-Photozyklus. Struktur 29, 743–754.e4 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takala, H. et al. Signalverstärkung und -transduktion in Phytochrom-Photosensoren. Natur 509, 245–248 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burgie, ES, Zhang, J. & Vierstra, RD Die Kristallstruktur von Deinococcus-Phytochrom im photoaktivierten Zustand zeigt eine Kaskade struktureller Umlagerungen während der Photoumwandlung. Struktur 24, 448–457 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Anders, K., Daminelli-Widany, G., Mroginski, MA, von Stetten, D. & Essen, LO Die Struktur des cyanobakteriellen Phytochrom-2-Photosensors impliziert einen Tryptophan-Schalter für die Phytochrom-Signalisierung. J. Biol. Chem. 288, 35714–35725 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Etzl, S., Lindner, R., Nelson, MD & Winkler, A. Strukturgesteuertes Design und funktionelle Charakterisierung einer künstlichen, durch rotes Licht regulierten Guanylat/Adenylatcyclase für optogenetische Anwendungen. J. Biol. Chem. 293, 9078–9089 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gourinchas, G. et al. Allosterische Fernsignalisierung in durch Rotlicht regulierten Diguanylylcyclasen. Wissenschaft. Adv. 3, e1602498 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Multamaki, E. et al. Eine vergleichende Analyse zweier Paradigmen-Bakteriophytochrome zeigt gegensätzliche Funktionalitäten bei der Zweikomponenten-Signalübertragung. Nat. Komm. 12, 4394 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Auldridge, ME & Forest, KT Bakterielle Phytochrome: mehr als man denkt. Krit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 46, 67–88 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bhoo, SH, Davis, SJ, Walker, J., Karniol, B. & Vierstra, RD Bakteriophytochrome sind photochrome Histidinkinasen, die ein Biliverdin-Chromophor verwenden. Natur 414, 776–779 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yeh, KC, Wu, SH, Murphy, JT & Lagarias, JC Ein cyanobakterielles Phytochrom-Zweikomponenten-Lichtsensorsystem. Science 277, 1505–1508 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, FW et al. Phytochrom-Diversität in Grünpflanzen und der Ursprung kanonischer Pflanzen-Phytochrome. Nat. Komm. 6, 7852 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Elich, TD & Chory, J. Phytochrom: Wenn es wie eine Histidinkinase aussieht und riecht, ist es dann eine Histidinkinase? Cell 91, 713–716 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, H., Burgie, ES, Gannam, ZTK, Li, H. & Vierstra, RD Pflanzliches Phytochrom B ist ein asymmetrisches Dimer mit einzigartigem Signalpotenzial. Natur 604, 127–133 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yeh, KC & Lagarias, JC Eukaryotische Phytochrome: lichtregulierte Serin/Threonin-Proteinkinasen mit Histidinkinase-Abstammung. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 95, 13976–13981 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsushita, T., Mochizuki, N. & Nagatani, A. Dimere der N-terminalen Domäne von Phytochrom B sind im Zellkern funktionsfähig. Natur 424, 571–574 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Krall, L. & Reed, JW Die Histidinkinase-verwandte Domäne ist an der Funktion von Phytochrom B beteiligt, aber entbehrlich. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 97, 8169–8174 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boylan, MT & Quail, PH Sind die Phytochrome Proteinkinasen? Protoplasma 195, 12–17 (1996).

Artikel CAS Google Scholar

Oka, Y. et al. Funktionsanalyse eines 450 Aminosäuren langen N-terminalen Fragments von Phytochrom B in Arabidopsis. Pflanzenzelle 16, 2104–2116 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ni, W. et al. Ein gegenseitig gesicherter Zerstörungsmechanismus schwächt die Lichtsignalisierung bei Arabidopsis. Wissenschaft 344, 1160–1164 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pham, VN, Kathare, PK & Huq, E. Phytochrome und Phytochrom-Interaktionsfaktoren. Pflanzenphysiologie. 176, 1025–1038 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Burgie, ES, Bussell, AN, Walker, JM, Dubiel, K. & Vierstra, RD Kristallstruktur des Photosensing-Moduls aus einem rotes/dunkelrotes Licht absorbierenden pflanzlichen Phytochrom. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, 10179–10184 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagano, S. et al. Strukturelle Einblicke in die Photoaktivierung und Signalübertragung in pflanzlichen Phytochromen. Nat. Pflanzen 6, 581–588 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cai, Y. et al. Konformationsdynamik der essentiellen Sensor-Histidinkinase WalK. Acta Crystallogr. D 73, 793–803 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Diensthuber, RP, Bommer, M., Gleichmann, T. & Moglich, A. Die Struktur einer Sensor-Histidinkinase in voller Länge identifiziert koaxiale Spulen als Signalwandler und Modulatoren. Struktur 21, 1127–1136 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, C. et al. Mechanistische Erkenntnisse anhand der Kristallstruktur einer Histidinkinase mit Signalwandler- und Sensordomänen. PLoS Biol. 11, e1001493 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Casino, P., Rubio, V. & Marina, A. Strukturelle Einblicke in die Partnerspezifität und den Phosphoryltransfer bei der Zweikomponenten-Signaltransduktion. Zelle 139, 325–236 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, J. et al. Verbesserte Vorhersage der Proteinstruktur mithilfe der vorhergesagten Orientierungen zwischen den Resten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 1496–1503 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burgie, ES et al. Die Photosensierung und Thermosensierung durch Phytochrom B erfordert sowohl proximale als auch distale allosterische Merkmale innerhalb des dimeren Photorezeptors. Wissenschaft. Rep. 7, 13648 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, X. et al. Lichtsignalmechanismus zweier Tandem-Bakteriophytochrome. Struktur 23, 1179–1189 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wagner, JR, Brunzelle, JS, Forest, KT & Vierstra, RD Ein lichtempfindlicher Knoten, der durch die Struktur der Chromophor-Bindungsdomäne von Phytochrom aufgedeckt wird. Natur 438, 325–331 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Essen, LO, Mailliet, J. & Hughes, J. Die Struktur eines vollständigen Phytochrom-Sensormoduls im Pr-Grundzustand. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 105, 14709–14714 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, X., Kuk, J. & Moffat, K. Kristallstruktur von Pseudomonas aeruginosa-Bakteriophytochrom: Photokonversion und Signaltransduktion. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 105, 14715–14720 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maloof, JN et al. Natürliche Variation der Lichtempfindlichkeit von Arabidopsis. Nat. Genet. 29, 441–446 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shin, AY et al. Hinweise darauf, dass Phytochrom als Proteinkinase bei der Lichtsignalisierung von Pflanzen fungiert. Nat. Komm. 7, 11545 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oka, Y. et al. Arabidopsis-Phytochrom A ist modular aufgebaut, um die zahlreichen Merkmale zu integrieren, die für ein hochsensibilisiertes Phytochrom erforderlich sind. Pflanzenzelle 24, 2949–2962 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagano, S. et al. Die Kristallstrukturen des N-terminalen photosensorischen Kernmoduls von Agrobacterium phytochrome Agp1 als parallele und antiparallele Dimere. J. Biol. Chem. 291, 20674–20691 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Woitowich, NC et al. Strukturelle Grundlage für die Lichtsteuerung der Zellentwicklung, offenbart durch Kristallstrukturen eines myxobakteriellen Phytochroms. IUCrJ 5, 619–634 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burgie, ES et al. Kristallographische und elektronenmikroskopische Analysen eines bakteriellen Phytochroms zeigen lokale und globale Umlagerungen während der Photokonversion. J. Biol. Chem. 289, 24573–24587 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, H. et al. PCH1 reguliert Licht, Temperatur und zirkadiane Signale als strukturelle Komponente von Phytochrom-B-Photokörpern in Arabidopsis. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 116, 8603–8608 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Golonka, D. et al. Dekonstruktion und Umnutzung des lichtregulierten Zusammenspiels zwischen Arabidopsis-Phytochromen und interagierenden Faktoren. Komm. Biol. 2, 448 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kikis, EA, Oka, Y., Hudson, ME, Nagatani, A. & Quail, PH Im lichtempfindlichen Knoten von Phytochrom B geclusterte Reste sind für die konformerspezifische Bindung an den Signalpartner PIF3 notwendig. PLoS Genet. 5, e1000352 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibson, DG et al. Enzymatischer Aufbau von DNA-Molekülen mit bis zu mehreren hundert Kilobasen. Nat. Methoden 6, 343–345 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wagner, JR et al. Die Mutationsanalyse des Bakteriophytochroms von Deinococcus radiodurans enthüllt wichtige Aminosäuren, die für die Photochromie und den Protonenaustauschzyklus von Phytochromen notwendig sind. J. Biol. Chem. 283, 12212–12226 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: Anisotrope Korrektur der strahlinduzierten Bewegung für eine verbesserte Kryo-Elektronenmikroskopie. Nat. Methoden 14, 331–332 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: schnelle und genaue Defokusschätzung aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen. J. Struktur. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Fernandez-Leiro, R. & Scheres, SHW Ein Pipeline-Ansatz zur Einzelpartikelverarbeitung in RELION. Acta Crystallogr. D 73, 496–502 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Sanchez-Garcia, R. et al. DeepEMhancer: eine Deep-Learning-Lösung für die Nachbearbeitung von Kryo-EM-Volumen. Komm. Biol. 4, 874 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A. & Fleet, DJ 3D-Variabilitätsanalyse: Auflösung kontinuierlicher Flexibilität und diskreter Heterogenität aus Einzelpartikel-Kryo-EM. J. Struktur. Biol. 213, 107702 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera – ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse. J. Comput. Chem. 25, 1605–1612 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr. D 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liebschner, D. et al. Bestimmung der makromolekularen Struktur mithilfe von Röntgenstrahlen, Neutronen und Elektronen: jüngste Entwicklungen bei Phenix. Acta Crystallogr. D 75, 861–877 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Williams, CJ et al. MolProbity: mehr und bessere Referenzdaten für eine verbesserte Validierung der Gesamtatomstruktur. Proteinwissenschaft. 27, 293–315 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Goddard, TD et al. UCSF ChimeraX: Bewältigung moderner Herausforderungen in der Visualisierung und Analyse. Proteinwissenschaft. 27, 14–25 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gasteiger, E. et al. in The Proteomics Protocols Handbook (Hrsg. Walker, JM) 571–607 (Humana Press, 2005).

Referenzen herunterladen

Kryo-EM-Daten wurden mit einem Titan-Krios-Mikroskop in der David Van Andel Cryo-Electron Microscopy Suite am Van Andel Institute gesammelt. Wir danken G. Zhao und X. Meng für Hilfe bei der EM-Datenerfassung, H. Zaher für Hilfe bei den Kinase-Assays und C. Sherman für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die R01-Zuschüsse GM127892 und GM127892-05 (an RDV) und GM131754 (an Huilin Li) der US National Institutes of Health sowie durch Mittel der Washington University in St. Louis (an RDV) und des Van Andel Institute finanziert (zu Huilin Li).

Katrice E. McLoughlin

Aktuelle Adresse: Burning Rock Dx, Irvine, CA, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: E. Sethe Burgie, Hua Li, Zachary TK Gannam.

Abteilung für Biologie, Washington University in St. Louis, St. Louis, MO, USA

E. Sethe Burgie, Zachary TK Gannam, Katrice E. McLoughlin und Richard D. Vierstra

Abteilung für Strukturbiologie, Van Andel Institute, Grand Rapids, MI, USA

Hua Li & Huilin Li

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

ESB, Hua Li, ZTKG, RDV und Huilin Li haben die Experimente entworfen. Hua Li führte die Kryo-EM und die 3D-Rekonstruktion durch. ESB und Hua Li bauten und verfeinerten die Atommodelle. ESB, ZTKG und KEM exprimierten und reinigten die gesammelten Phy-Proben und führten die Mutagenese und spektroskopische Tests durch. ESB, Hua Li, ZTKG, Huilin Li und RDV haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Richard D. Vierstra oder Huilin Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Plants dankt Andreas Möglich, Xiaojing Yang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, SDS-PAGE-Analyse des rekombinanten PhyA voller Länge. Die Gele wurden entweder mit Coomassie-Blau auf Protein gefärbt (links) oder durch zinkinduzierte Fluoreszenz auf gebundenes PΦB untersucht (rechts). MM, Molekularmassenstandards. Die Proben waren nicht von den von Burgie et al. beschriebenen Proben zu unterscheiden.6 b, UV-Vis-Absorptionsspektren von PhyA. Die Spektren wurden von dunkeladaptierten Proben (Pr) oder nach sättigender Bestrahlung mit 630-nm-Rotlicht (RL, meist Pfr) gesammelt. Aus dem dargestellten Differenzspektrum wurden Absorptionsmaxima bei 70 % Amplitude ermittelt. Der SCR bei 664/723 nm ist in Klammern angegeben. Die Spektren waren der Durchschnitt von drei technischen Replikaten. c, Workflow für die Datenverarbeitung der Kryo-EM-Bilder von PhyA. In der ersten verfeinerten Gesamtkarte mit einer Auflösung von 3,5 Å basierend auf 421.969 Partikeln waren fast alle PhyA-Domänen gut zu erkennen, mit Ausnahme der Regionen, die die PAS1-Domänen umfassten, die schlecht aufgelöst waren. Durch gezielte Verfeinerungen, unter Ausschluss der PAS1-Domänen und unter Verwendung der Signalsubtraktion für die PSM-, PAS2- und HKRD-Regionen, wurde eine 3,2-Å-Karte mit einigen Mehrdeutigkeiten in den HKRDs erstellt. Die anschließende Verwendung separater Masken für die HKRDs und die Plattform führte zu verbesserten 3,1-Å- und 3,4-Å-EM-Karten für die Plattform bzw. die HKRDs, die kombiniert wurden, um die endgültige zusammengesetzte Karte des Dimers zu erzeugen. 3DVA von Partikelbildern, heruntergesampelt auf 4,14 Å pro Pixel, löste eine der flexiblen PAS1-Domänen (lila) mit einer Auflösung von ~15 Å auf. d, Dargestellt ist eine repräsentative Kryo-EM-Aufnahme nach Bewegungskorrektur. Insgesamt wurden Daten von 6.195 unabhängigen Mikroaufnahmen für die Kartenerstellung verwendet. e, Ausgewählte 2D-Klassenmittelwerte, die mehrere Ansichten der Partikel zeigen.

a: Die 3D-EM-Konsenskarte und die schwerpunktmäßig verfeinerten individuellen Plattform- und HKRD-Karten, farbcodiert nach lokaler Auflösung. b, Eulersche Winkelverteilung der Rohpartikelbilder, die in der endgültigen 3D-Rekonstruktion verwendet werden. c: Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelation (FSC) zweier Halbkarten (orange Kurve) und die Korrelation des Atommodells und der endgültigen zusammengesetzten 3D-Karte (violette Kurve).

Die Karte wird in grauem Netz dargestellt, während die 3D-Modelle der Motive/Rückstände in Cartoons/Stäbchen dargestellt und wie in Abb. 1e gefärbt sind. Die Felder ac enthalten PΦB (rote Stäbchen), um die Nähe zum Chromophor hervorzuheben. Wichtige Rückstände sind angegeben. a, Knoten-Lasso, das sich von der GAF-Domäne aus erstreckt und die N-terminale Erweiterung (NTE) direkt stromaufwärts der nPAS-Domäne umschließt. b, Reste 69–81, die einen Teil des NTE in der Nähe des Knotenlassos umfassen, das in die Nähe des Chromophors reicht. c, Orthogonale Ansichten der Haarnadel, die sich von der PHY-Domäne bis zur GAF-Domäne in der Nähe des Chromophors erstreckt. d, Die Modulatorschleife, die sich zwischen den PAS1- und PAS2-Domänen erstreckt, um mit der PHY-Domäne ihres eigenen Protomers zu interagieren. e, Die gepaarten DHp-Domänen innerhalb des HKRD. Die Helices α1 und α2 sind angegeben. Das kreuzförmige Merkmal innerhalb der Helix α1 wird durch die Klammern lokalisiert. Der Rest 905 (R905), der in Transmitter-Histidinkinasen normalerweise von einem Histidin besetzt ist, ist durch das rote Oval hervorgehoben. f, Nahaufnahmen der Verbindungen zwischen der PAS2-Domäne von Protomer B und den nPAS- und GAF-Domänen von Protomer A innerhalb des Dimers. g: Strukturelle Vorhersage der PAS1-Faltung durch TrRosetta (links) und Übereinstimmung dieser Vorhersage (grau) mit den Kryo-EM-Modellen der PAS2- (Mitte) und nPAS-Domänen von PhyA (rechts), farbig dargestellt. Die N- und C-terminalen Enden sind angegeben. In den Feldern (e) und (f) ist das Peptidrückgrat als Cartoon dargestellt, während die Aminosäureseitenketten in Stäbchenform dargestellt sind. Die A-Bezeichnungen kennzeichnen Reste des B-Protomers.

Die komplexen Zusammenhänge der Domänen innerhalb des PSM werden in den oberen drei Ansichten dargestellt. Die vierte und fünfte Ansicht heben die Modulatorschleife (Mod)/PHY-Domänenverbindung hervor, die eine strukturelle Verbindung innerhalb des Protomers mit dem PSM herstellt, und ihre Konnektivität mit den Merkmalen der Haarnadel, des helikalen Rückgrats und der PAS2-Domäne. Die sechste Ansicht zeigt eine Hälfte der dimeren Schnittstelle des HKRD, an der die α-Helices der DHp- und CA-Domäne beteiligt sind. Wichtige Rückstände sind angegeben; Primzahlbezeichnungen weisen auf Protomer B hin.

a, Diagramme der Kontakte. Dargestellt sind die interagierenden Regionen im Kontext ihrer α-helikalen, β-Strang- oder Schleifenkonfigurationen. Die linken Diagramme verdeutlichen die HKRD-Interprotomer-Wechselwirkungen zwischen den DHp- und CA-Domänen. Die rechten Diagramme verdeutlichen die Interaktionen zwischen den Domänen HKRD (Cyan/Blaugrün) und GAF ​​(Grün) sowie PHY (Orange) innerhalb der Plattform. Die Linien lokalisieren die spezifischen Reste, die an den vorhergesagten Kontakten beteiligt sind; Dargestellt sind Verbindungen innerhalb von PhyA, PhyB oder beiden. (A) und (B) beziehen sich auf die A- bzw. B-Protomere innerhalb des Dimers. Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht denen in PhyA oder PhyB. Einige Stränge oder Helices werden für den strukturellen Kontext einbezogen, es wurde jedoch nicht festgestellt, dass sie an den Wechselwirkungen beteiligt sind. b, Sequenzausrichtung der Regionen innerhalb von AtPhyA und AtPhyB, die an den in (a) gezeigten Kontakten beteiligt sind. Identische und ähnliche Aminosäuren sind in schwarzen bzw. grauen Kästchen eingefärbt. Die Balken oben markieren die α-helikalen (rot) und β-strängigen (blau) Strukturen. Die grünen Kreise unten kennzeichnen spezifische Aminosäuren, die an den in (a) gezeigten Kontakten beteiligt sind.

a, Domänenorganisation von PhyA- und NTE-Verkürzungen voller Länge (FL), beginnend bei Rest 25 (NΔ24) und 66 (NΔ65). Die Länge des NTE wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit verlängert. Gestrichelte rote Linien stellen die Wechselwirkung von PΦB mit den NTE-Resten Tyr-70 und Ile-74 dar. b, Thermische Umkehrraten von FL PhyA und seinem PSM mit den NTE-Verkürzungen NΔ24 und NΔ65. Es werden Datenpunkte und Anpassungslinien angezeigt, die für drei technische Replikate repräsentativ sind (statistische Analysen finden Sie in der erweiterten Datentabelle 2). Ebenfalls enthalten sind Daten zur thermischen Pfr→Pr-Reversion für PSM-Fragmente von Arabidopsis PhyA mit vergleichbaren NTE-Verkürzungen, die hier der Vollständigkeit halber erneut gemessen wurden, siehe auch Burgie et al.6. Da sich die Reaktionsgeschwindigkeiten um Größenordnungen unterscheiden, werden die Geschwindigkeiten in zwei Zeitskalen angezeigt: linkes Feld, 120 Minuten; rechtes Bild, 1200 Min. SDS-PAGE-Gele sowie Absorptions- und Pr-Pfr-Differenzspektren für die Präparate sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 1 und 2.

a, Orthogonale Ansichten der HKRD-CA-Region von At PhyA, überlagert mit der gleichen Region von At PhyB (PDB-ID-Code 7RZW22) und dem prokaryotischen Walk-Transmitter HK von Lactobacillis plantarum (Lp) (PDB-ID-Code 4U7O32). b und c: Modelle, die die vorhergesagte Position von ADP (rot) in der At PhyA CA-Domäne basierend auf der in Lp WalK32 beschriebenen Bindungstasche zeigen. Rückstände, von denen erwartet wird, dass sie an der Bindung beteiligt sind, sind in (b) angegeben. ADP kollidiert mit mehreren Resten in der Tasche dieses vorhergesagten PhyA-ATP-Modells, was darauf hindeutet, dass durch ATP oder Photoaktivierung induzierte Konformationsverschiebungen in At PhyA für die Bindung notwendig wären. Standorte mit erheblichen Konflikten sind eingekreist. d, Aminosäuresequenz-Alignment der möglichen ATP-Bindungstasche von At PhyA und At PhyB mit vergleichbaren CA-Domänen von echten Histidinkinasen aus Bacillus subtilis (Bs YFI), Thermotoga maritima (Tm HK853), L. plantarum (Lp Walk) und Streptococcus mutans (Sm Vick) und mit denen aus bakteriellem Phys (BphPs) mit HK/Phosphatase-Aktivitäten aus Pseudomonas syringae (Ps BphP)18 und Deinococcus radiodurans (Dr BphP)16. Identische und ähnliche Aminosäuren sind in schwarzen bzw. grauen Kästchen eingefärbt. Die charakteristischen Kästchen N, G1/D, F und G2 sowie der ATP-Deckel für Histidinkinasen sind angegeben32. Pfeilspitzen lokalisieren wichtige Reste innerhalb der ATP-Bindungstasche, die für die Katalyse entscheidend sind32. Beispielsweise ist At PhyA im Vergleich zu Ps BphP eine schlechte Kinase, basierend auf Autophosphorylierungstests. Äquimolare Mengen rekombinanter Biliproteine ​​wurden 1 Minute bis 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur (~24 °C) mit 150 μM ATP, ergänzt mit 10 μCi [γ-32P]-ATP, inkubiert, mit SDS-PAGE-Probenpuffer gequencht und gemessen 32P-Einbau durch Autoradiographie von SDS-PAGE-Gelen. e, Zeitverlauf für die Autophosphorylierung von Ps BphP als Pfr. f, Vergleiche der Autophosphorylierungsaktivitäten von At PhyB als Pr und Pfr mit denen von Ps BphP nach 2-stündiger Inkubation. Pfeilspitzen lokalisieren Ps BphP. Die Phosphorimager-Scans sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. g, Bilder der SDS-PAGE-Gele, die mit Coomassie-Blau auf Protein oder durch zinkinduzierte Fluoreszenz auf gebundenes Bilin gefärbt wurden.

Ergänzungstabelle 1 und Abbildungen. 1–3.

Film des PhyA-Dimers in voller Länge, aufgelöst mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,2 Å. Der Film zeigt zunächst eine rotierende EM-Karte, gefolgt von einer rotierenden Cartoon-Ansicht des resultierenden Modells. Die Domänen NTE, nPAS, GAF, PHY mit Haarnadel, PAS2 mit Modulator und HKRD sind in den Farben Grau/Schwarz, Hell/Dunkelblau, Hell/Dunkelgrün, Gelb/Orange, Rosa/Magenta bzw. Hellcyan/Blaugrün erhältlich. PΦB wird in roten Strichen angezeigt.

Der HKRD von Arabidopsis PhyA geht keine starken nichtkovalenten Kontakte mit der Plattform ein. 3DVA wurde verwendet, um die Bewegung des HKRD in Bezug auf die Plattform in PhyA zu beschreiben. Mit diesem Verfahren wurden 20 EM-Karten erstellt, indem Rahmen ähnlicher Strukturen gemittelt wurden, wie in der Grafik angegeben. Wir zeigen vier orthogonale Ansichten der EM-Karte von PhyA, um die Bewegung von Domänen zu verfolgen. Die Domänenpositionen werden angezeigt, einschließlich derjenigen für die PAS1-Domäne, die in der Nähe der PHY- und PAS2-Domänen innerhalb der Plattform erscheint. Die Kartennummern sind oben links angegeben.

Quelldaten für Größenausschlusschromatographie, UV-Vis-Spektren und Diagramme der thermischen Umkehrkinetik in den Abbildungen. 5–7.

Springer Nature oder sein Lizenzgeber (z. B. eine Gesellschaft oder ein anderer Partner) besitzen die ausschließlichen Rechte an diesem Artikel im Rahmen einer Veröffentlichungsvereinbarung mit dem Autor bzw. den Autoren oder anderen Rechteinhabern. Die Selbstarchivierung der akzeptierten Manuskriptversion dieses Artikels durch den Autor unterliegt ausschließlich den Bedingungen dieser Veröffentlichungsvereinbarung und geltendem Recht.

Nachdrucke und Genehmigungen

Burgie, ES, Li, H., Gannam, ZTK et al. Die Struktur des Arabidopsis-Phytochroms A zeigt eine topologische und funktionelle Diversifizierung zwischen den pflanzlichen Photorezeptor-Isoformen. Nat. Pflanzen (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01435-8

Zitat herunterladen

Eingegangen: 14. Dezember 2022

Angenommen: 10. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01435-8

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt