Schallwellen zur Lösung des Problems der Rekristallisation bei der Kryokonservierung

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7603 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das anstehende Thema der Kryokonservierung ist das Organ-Biobanking. Obwohl das Problem vielschichtig ist, haben die Fortschritte der letzten Jahrzehnte es größtenteils mit der Erzielung einer schnellen und gleichmäßigen Wiedererwärmung kryokonservierter Proben in Verbindung gebracht. Dies ist eine physikalische Herausforderung, die in der Vergangenheit weitgehend untersucht wurde, zusätzlich zu Studien zur Toxizität von Kryoschutzmitteln, die ebenfalls große Fortschritte gezeigt haben. In diesem Artikel wird anhand des Fadenwurms Caenorhabditis elegans ein Machbarkeitsnachweis einer Technologie vorgestellt, die eine solche Funktion erfüllen kann: hochintensiver fokussierter Ultraschall. Um das Problem der Rekristallisation zu vermeiden, wurde dieser Wurm im erwachsenen Zustand, konserviert bei − \(80\;^\circ{\rm C}\), systematisch wieder zum Leben erweckt, nachdem er mit hochintensivem fokussiertem Ultraschall erhitzt wurde (HIFU) Wellen. Der große Vorteil dieser Technologie besteht darin, dass sie skalierbar ist; Darüber hinaus kann die Wiedererwärmung in Echtzeit durch MRT-Thermographie überwacht und durch akustische Interferometrie gesteuert werden. Wir gehen davon aus, dass unsere Erkenntnisse den Ausgangspunkt für einen möglichen Ansatz zur Wiedererwärmung darstellen, der für die Kryokonservierung von Systemen im Millimeterbereich verwendet werden kann: Entweder allein oder in Kombination mit anderen vielversprechenden Methoden der Erwärmung, wie Nanoerwärmung oder dielektrischer Erwärmung, bietet die vorliegende Technologie neue Möglichkeiten die physikalischen Aspekte des Problems der Rekristallisation bei der Kryokonservierung zu lösen und so die Tür für die Langzeitlagerung größerer Proben zu öffnen.

Die Konservierung von Organen in Banken bei niedrigen Temperaturen bietet unzählige Möglichkeiten1,2. Derzeit ist diese Möglichkeit noch nicht erkennbar, mit nur einigen Teil- und Einzelerfolgen, z. B. in der Kaninchenniere, im Eierstock oder in der Leber von Schafen3,4,5. Obwohl es unterschiedliche Kryokonservierungsstrategien für die langfristige kryogene Lagerung von Organen gibt, ist der Schaden, der durch das eventuelle Auftreten von Eiskristallen verursacht wird, maßgeblich für diese Situation verantwortlich. In den folgenden Abschnitten werden wir versuchen, das Problem in den allgemeinen Kontext der Kryokonservierung einzuordnen. Als nächstes werden wir verstehen, warum dies durch eine schnelle und gleichmäßige Wiedererwärmung vermieden werden kann. Abschließend werden wir sehen, wie hochintensiver fokussierter Ultraschall die Lösung bieten kann.

Bereits 1940 erkannte Luyet6, dass die Verglasung biologischer Systeme einfach dadurch möglich war, dass man die Zone durchquerte, in der Eis mit ausreichender Geschwindigkeit entstehen konnte. Dies ist in Abb. 1 symbolisch dargestellt: Wenn die Temperatur steigt oder fällt, gehen wir von einer Phase in die andere über; Allerdings können wir eine bestimmte Phase überspringen, wenn die Temperaturänderung schnell genug erfolgt. So können wir von Flüssigkeit zu Glas und umgekehrt übergehen, ohne den kristallinen Zustand zu durchlaufen; Hierzu reicht es aus, dass die charakteristische Zeit dieses Übergangs kürzer ist als die charakteristische Zeit, die für die Keimbildung und das Wachstum des Eises erforderlich ist.

Auswirkungen von Abkühl- und Erwärmungsraten auf die Phasenänderung eines wässrigen Systems. Die horizontale Achse stellt die Temperatur in Kelvin dar, wobei die Übergangstemperaturen zwischen den vier Zuständen (Glas, Kristall, Flüssigkeit und Gas) mit Tglass (Glasübergangstemperatur), Tmelt (Schmelztemperatur) und Tboil (Verdampfungstemperatur) gekennzeichnet sind. Diese Achse kann in beide Richtungen durchlaufen werden, entsprechend den Zustandsänderungen beim Überqueren der markierten Temperaturen. Die vertikale Achse stellt die Geschwindigkeit dar, mit der die Temperaturänderung auftritt. Anschaulich wird die Anordnung der Moleküle des Systems für die vier genannten Zustände dargestellt. In diesem Diagramm ist die Geschwindigkeit, mit der es die markierten Temperaturen durchläuft, von besonderem Interesse, wobei für das Thema, das uns beschäftigt, der Übergang vom flüssigen in den glasigen Zustand am relevantesten ist. Eine zu langsame Temperaturänderung (niedrige Werte auf der vertikalen Achse), um von der flüssigen in die glasartige Phase und umgekehrt zu gelangen, impliziert den notwendigen Durchgang durch die kristalline Phase, was in wässrigen Systemen die Bildung von Eis zur Folge hat. Stattdessen umgehen hohe Abkühlungs- und/oder Erwärmungsraten (hohe Werte auf der vertikalen Achse) den „kristallinen“ Bereich und führen zu einem direkten Wechsel zwischen dem flüssigen und glasartigen Zustand.

Das Problem, auf das Luyet stieß, bestand darin, dass solche Abkühlungs- und Erwärmungsraten in Systemen, die größer als einige zehn Mikrometer waren, oft nicht zu erreichen waren. Obwohl ihm bewusst war, dass diese Geschwindigkeiten durch die Zugabe von gelösten Stoffen gesenkt werden könnten, beschloss er, einen anderen Weg einzuschlagen: den Versuch, sie durch eine Verbesserung der Wärmeübertragung zu erreichen. Daher konnte er durch den Prozess nur eine kleine Anzahl winziger biologischer Systeme retten.

Erst mit der Entdeckung von Glycerin7 lagen diese Geschwindigkeiten im Rahmen des technisch Machbaren. Dafür ist die durch extrazelluläres Eis erzeugte Dehydrierung unerlässlich8,9. Es handelt sich um die Technik des langsamen Einfrierens, die derzeit in Tausenden von Laboren eingesetzt wird.

Anschließend führte das Aufkommen anderer Kryoschutzmittel zur Entwicklung von Alternativen zum langsamen Einfrieren. Diese benötigen kein extrazelluläres Eis, um die Verglasung des Zellinneren zu erreichen. Aufgrund dieser völligen Abwesenheit von Eis sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zellen erhalten sie den Oberbegriff Vitrifikationstechniken. In diesem Fall unterscheidet man üblicherweise zwischen Gleichgewichts- und Nichtgleichgewichtsvitrifikation, d. h. Bei der Gleichgewichtsvitrifikation – nach Farrant10 – werden dem System mit sinkender Temperatur steigende Konzentrationen an Kryoschutzmittel zugesetzt, wodurch in gewissem Maße die Wirkung von extrazellulärem Eis beim langsamen Gefrieren nachgeahmt wird. Aufgrund seiner Toxizität11,12 wird die Menge des Kryoschutzmittels für jede Temperatur auf ein Minimum beschränkt, gerade genug, um Eisbildung zu vermeiden, indem das thermodynamische Gleichgewichtsdiagramm zwischen Feststoff und Flüssigkeit befolgt wird; daher der Name10,13,14,15. Im Gegensatz dazu wird bei der als Nichtgleichgewichtsvitrifizierung bekannten Technik das gesamte Kryoschutzmittel von Anfang an oder in einer reduzierten Anzahl von Schritten zugegeben, aber im Allgemeinen immer bei Temperaturen über Null und in Konzentrationen, die die Vitrifizierung durch einfaches Eintauchen erreichen können die Probe in flüssigem Stickstoff16,17. Offensichtlich gibt es Zwischenstrategien. In ihnen folgt die Konzentration des Kryoschutzmittels nicht der Linie des Phasendiagramms, sondern bleibt innerhalb der begrenzten Bandbreite zwischen der Möglichkeit einer Unterkühlung und der Toxizitätsgrenze3,18; oder man spielt mit der Vereinbarkeit des Lebens mit einem gemäßigten Eisauftritt19,20. Zusammenfassend und mit Fokus auf das, was uns hier beschäftigt: (1) Kryokonservierungstechniken unterscheiden sich grundlegend in der Menge an Kryoschutzmittel, die dem System für jede Temperatur zur Verfügung steht; (2) die Menge an Kryoschutzmittel bestimmt die Position, Breite und Geschwindigkeit, mit der diese Zone in Abb. 1 in beide Richtungen durchquert werden muss, um Eisbildung zu vermeiden21; und (3) diese Menge an Kälteschutzmittel wird angesichts seiner Toxizität auf jeden Fall auf ein Minimum beschränkt. Bei alledem konzentriert sich das Problem heute auf die Optimierung von drei Faktoren: Stofftransport, Wärmeübertragung und die Toxizität von Kryoschutzmitteln. Und hier kommen grundsätzlich die Geometrie und Abmessungen des Systems ins Spiel und damit auch der Ursprung der Schwierigkeit bei der Kryokonservierung von Organen: Mit kleinen Systemen können sehr hohe Kühl-/Erwärmungsraten erreicht und somit die Konzentration aufrechterhalten werden Kryoprotektivum niedrig22. Wenn die Systeme jedoch groß sind, ist es schwieriger, dieses Gleichgewicht zwischen Toxizität und Wärmeübertragung zu erreichen, sodass Eis häufig auf tödliche Weise auftritt, sowohl bei Systemen, die durch langsames Gefrieren23 als auch durch Vitrifizierung verglast werden4,24, wenn auch im Allgemeinen mit sehr unterschiedlichen Parametern Werte, aber der Ursprung des Problems ist in beiden Fällen grundsätzlich derselbe.

Paradoxerweise lässt sich die Bildung tödlicher Eiskristalle bei der Abkühlung leichter vermeiden als bei der Erwärmung21. Der Ursprung dieses merkwürdigen Verhaltens liegt in der Existenz einer doppelten Notwendigkeit für das Erscheinen dieser Kristalle: der ihrer Keimbildung und der ihres Wachstums. Da das Wachstum eine niedrige Viskosität erfordert, erfolgt es vorzugsweise bei hohen Temperaturen. Allerdings ist die Keimbildung am wahrscheinlichsten bei sehr niedrigen Temperaturen, im Allgemeinen nahe Tg (typischerweise \(\sim -100 \; ^\circ{\rm C}\) für Lösungen und \(\sim -47 \; ^\circ{ \rm C}\) für Zellen25). Wenn also ein System abkühlt, durchquert es zunächst die „Wachstumszone“, aber vorerst gibt es „nichts zum Wachsen“ (noch keine Kerne). Erst wenn die Keimbildungszone erreicht ist, können kleine Eisembryonen entstehen, die nicht wachsen und daher grundsätzlich nicht tödlich sind. Abschließend wird das System verglast und gespeichert. Beim Wiedererwärmen kann es jedoch zu einer Rekristallisation (oder sogar Entglasung) kommen26. Die Wiedererwärmung beginnt mit der Durchquerung und zum zweiten Mal der Zone hoher Keimbildung, mit der möglichen Entstehung neuer Embryonen; tatsächlich wies Boutron27 darauf hin, dass beim Wiedererwärmen aus dem amorphen Zustand bis zu \({10}^{12}\) mal mehr Kerne vorhanden sind als beim Abkühlen aus dem flüssigen Zustand. Schließlich wird die Wachstumszone erneut durchquert, wo sich nun eine beträchtliche Anzahl opportunistischer Keime befindet, die eine tödliche Größe erreichen können. Diese Kristalle, die, wie wir sagen, während der Wiedererwärmung zahlreicher werden, erfahren ein begünstigtes Wachstum, wenn die Temperatur steigt28. Der Weg, dieses Wachstum zu vermeiden, besteht darin, dieses Gebiet sehr schnell zu durchqueren. Deshalb ist eine hohe Erwärmungsrate entscheidend und in gewissem Sinne wichtiger als die Abkühlungsrate; Die Bedeutung der Wiedererwärmung wurde kürzlich als Paradigmenwechsel in der Kryokonservierung hervorgehoben24. Der interessierte Leser findet in der Bibliographie eine ausführliche und detaillierte Analyse der in diesem Absatz behandelten Themen29.

Bei Systemen, die durch langsames Einfrieren kryokonserviert werden, wie es in dieser Studie der Fall ist, wurde im Gegensatz zur Vitrifizierung das Problem der Rekristallisation und die daraus resultierende Notwendigkeit hoher Erwärmungsraten in allen möglichen Situationen immer wieder festgestellt. Dies hat zur Empfehlung hoher Erwärmungsraten innerhalb der Good Manufacturing Processes (GMPs)30,31 geführt. Daher ist bekannt, wie auf diese Weise eine Rekristallisation in Proben von der Größe von Spermien32 bis hin zu Blutbeuteln30 vermieden wird, sogar in Kryoröhrchen in der Zelltherapie33. Ein interessanter Fall wurde kürzlich im Zusammenhang mit CAR-T34 untersucht, wo gemeinsame Kryomikroskopie- und Kalorimetriestudien den Vorteil hoher Erwärmungsraten zur Vermeidung von Rekristallisation identifiziert haben.

Um hohe Wiedererwärmungsgeschwindigkeiten zu erreichen, wurden aufgrund seiner Durchdringungskapazität und daher prinzipiell skalierbaren Formen der Anwendung des elektromagnetischen Feldes verschiedene Formen vorgeschlagen. Dieser Antrag wurde entweder direkt35,36,37,38 oder indirekt über einen Vermittler39,40,41 gestellt. In dieser Angelegenheit wurden kürzlich wichtige Fortschritte erzielt42. Eine Tabelle zum Vergleich der verschiedenen volumetrischen Heizmethoden finden Sie in den Zusatzinformationen.

Eine Alternative zum elektromagnetischen Feld, ebenfalls durchdringend43, ist der hochintensive fokussierte Ultraschall (HIFU)44. Der Ursprung der Anwendung von HIFU geht auf das Jahr 192745 zurück, als bereits davon gesprochen wurde, dass es sich um ein Gebiet mit einer Vielzahl von Untersuchungsmöglichkeiten handele. 15 Jahre später verbrannten die ersten Tumore durch die starke Hitze, die diese Wellen erzeugten46. Allerdings ermöglichten bildgebende Verfahren erst mit der Entwicklung der NMR47 eine HIFU-Kontrolle auf Basis der MRT-Thermographie. Heutzutage gibt es eine breite Palette verfügbarer MRT-Konfigurationen (Sequenzen), die es ermöglichen, 3D-Wärmebilder für viele Gewebe unter verschiedenen Umständen zu erhalten48. Andererseits ist zu beachten, dass die Dämpfung und Durchdringbarkeit des Ultraschalls eine Funktion seiner Frequenz ist (z. B. wird die Ultraschallwelle bei 1 MHz um etwa 50 % gedämpft, wenn sie sich durch 7 cm Weichgewebe ausbreitet, und bei 2 MHz). MHz wird die Welle durch dasselbe Gewebe auf etwa 25 % ihres Anfangswerts reduziert43). Daher ist es für große Proben ratsam, über eine Reihe von Wandlern zu verfügen, da dies die effektive Wellendurchdringung und Skalierbarkeit verbessert, indem die relativen Phasen der Welle jedes Kanals gesteuert und Veränderungen im Biomaterial und Inhomogenitäten (Brüche, Eis, …) in Echtzeit. In dieser Arbeit haben wir nur einen Transducer (mm-große Proben) verwendet; In früheren Computersimulationen haben wir 26 Wandler (cm-Größe) untersucht44. Heutzutage sind Geräte aus Tausenden von Wandlern üblich, die bei einer Vielzahl medizinischer Therapien eine Erwärmung mit einer Präzision von über einem Zehntel Grad ermöglichen49.

Unsere Forschungsgruppe veröffentlichte kürzlich44,50 das Ergebnis von Computersimulationen von HIFU zur Wiedererwärmung bei der Kryokonservierung mit dem Versprechen, es in der vorliegenden Arbeit in die Praxis umzusetzen. Hierfür haben wir C. elegans als Proof-of-Principle verwendet. Bei der herkömmlichen Kryokonservierung von C. elegans23,51 tritt das Problem der Rekristallisation auf, wodurch die Wiederfindungsrate in den kleinsten Larvenstadien – L1 und L2 – niedrig bleibt (35 %) und im Erwachsenenstadium praktisch Null ist51. Bei einer schnellen Wiedererwärmung tritt dies jedoch nicht ein52. In den folgenden Zeilen zeigen wir erstmals die Darstellung von HIFU zur Vermeidung des Problems der Rekristallisation anhand dieses Wurms. Hierzu wurden N2-Nematoden unter üblichen Bedingungen bei \(20\;\mathrm{^\circ{\rm C} }\) kultiviert. Nachdem sich die Population nach mindestens 5 Generationen stabilisiert hatte, wurde der Kryokonservierungsprozess durchgeführt. Für die Aufwärmung wurden immer zwei Gruppen gebildet: eine Kontrollgruppe, die auf übliche Weise aufgewärmt wurde23,51, und eine experimentelle Gruppe, die mit Ultraschall aufgewärmt wurde. In den folgenden Abschnitten werden die technischen Herausforderungen beschrieben, die es zu bewältigen galt, die Details der durchgeführten Experimente und schließlich die erzielten Ergebnisse.

Wie bereits erwähnt, mussten vor der Durchführung der Experimente eine Reihe praktischer Herausforderungen bewältigt werden. So wurde ein HIFU-Gerät aus einem Rechteckwellengenerator mit vier Leistungstransistoren mit ihren jeweiligen Treibern, einem 1,22-MHz-Oszillator, einem Mikrocontroller und verschiedenen passiven Elementen gebaut. Dieser Wellengenerator nimmt eine von einer externen Quelle bereitgestellte Transistorbrückenleistung von bis zu 200 W auf und liefert die Anregung an den HIFU-Wandler. Der HIFU-Wandler ist eine PTZ-8-Kugelkappe mit einem Krümmungsradius von 50,8 mm und einer Kappentiefe von 10 mm, die auf dem piezoelektrischen Effekt basiert, um elektrische Rechteckwellenerregung in eine mechanische Schwingung, d. h. in Druckwellen, mit proportionaler Amplitude umzuwandeln die Quadratwurzel der verwendeten Leistung. Die Kappe befindet sich in einer versiegelten Kammer, wie in Abb. 2a beschrieben. Die Resonanzfrequenz der Keramikkappe betrug 1,5 MHz, obwohl sie mit einer niedrigeren Frequenz gespeist wurde, wie am Generatorausgang in Abb. 2b zu sehen ist, um mögliche Überschneidungen in den Generatortransistoren zu vermeiden. Der Fokus, in dem der Ultraschall konzentriert wird, der von der Form und den Abmessungen des Wandlers abhängt, wurde unabhängig voneinander mit drei verschiedenen Methoden bestimmt: durch Thermografie mit einem Bolometer, durch Thermografie mit thermoempfindlicher Folie und mit Thermoelementen. Ziel der Messungen war es, den Abstand auf der Z-Achse zu bestimmen, in dem sich das Zentrum des Fokusbereichs befindet. Um präzise Werte zu erhalten, wurden die Schrittmotoren eines FDM CREALITY Ender 3-Pro-Druckers verwendet, um die Position der Thermoelementspitze mit einer Genauigkeit von 100 µm zu steuern. Die thermischen Experimente, die in verschiedenen Abständen von der Oberfläche der Kappe durchgeführt wurden (siehe Abb. S5), ergaben eine Position des Fokus bei 50,8 mm relativ zur Oberfläche, was den Punkt der maximalen Erwärmung darstellt. Dies stimmt vollkommen mit dem überein, was aufgrund der oben beschriebenen Geometrie des Wandlers zu erwarten ist.

Charakterisierung der hochintensiven fokussierten Ultraschallausrüstung. (a) Abschnitt des HIFU-Wandlers. A–D: PVC-Chassis, um Struktur, Abdichtung und Luftkammer hinter der Kappe bereitzustellen; E: leitfähiger Film für die Außenfläche der Kappe; F: leitfähiger Film für die Innenfläche der Kappe; G: Epoxiddichtmittel (außen und innen); H: Koaxialkabel; J: Luftkammer; K: PTZ-8 Keramikkugelkappe; L: Ablassschraube für die Luftkammer bei Infiltration. (b) Ausgang des Rechteckwellengenerators, ohne Stromversorgung durch die externe Quelle. Die Signalfrequenz beträgt 1,22 MHz, mit einer Amplitude von 18 V Spitze-Spitze. (c) Temperaturkurven, die durch Erhitzen mit HIFU bei verschiedenen Spannungen und Strömen der externen Stromversorgung erhalten wurden. Die Aufnahmen wurden für eine Belichtungszeit von 60 s normalisiert. Die erzielten Erwärmungsraten hingen von der Stromversorgung der externen Quelle ab. Da die Nennleistung des Piezos 25 W beträgt, führt ein Betrieb unterhalb dieser Leistung (bei der Kurve für 20 V und 0,68 A) zu einer Leistungsminderung. (d) Detail des Fokusbereichs der Ultraschallerwärmung. Der Wärmeübergang ist in einem eiförmigen Bereich mit den Abmessungen 12 × 15 mm am größten. Diese Werte wurden aus den Experimenten durch Thermographie mit wärmeempfindlicher Folie ermittelt, deren Beispiel in (e) dargestellt ist. (e) Thermografisches Profil der Erwärmung mit HIFU in Wasser bei Raumtemperatur. Durch die Erwärmung entstehen im Schnitt konzentrische Kreise zum Fokus. Zwischen dem heißesten und dem kältesten Punkt wird immer ein Temperaturunterschied von weniger als \(10 \;^\circ{\rm C}\) gemessen.

Bei unterschiedlichen Spannungen (im Bereich von 20–60 V) und Strömen (im Bereich von 680 mA bis 2,26 A) der Gleichstromversorgung für den Wellengenerator wurden die in Abb. 2c dargestellten Heizkurven vom Wandler durch Variation erhalten die Versorgungsleistung. Die vom Gerät erreichten Heizraten lagen bei den unterschiedlichen Versorgungsleistungen etwa zwischen 14 und 218 \(^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Als nächstes wurde die Form des Fokusbereichs als das Volumen charakterisiert, in dem zu jedem Zeitpunkt während der Wiedererwärmung die maximale Temperaturdifferenz zwischen zwei beliebigen Punkten immer weniger als \(10 \; ^\circ{\rm C}\) betrug. Es entstand ein Ovoid mit den Maßen 12,4 × 15,4 mm. Diese Werte sind in Abb. 2d und e zu sehen.

Um sicherzustellen, dass die gesamte Nematodenpopulation, die in der kryoprotektiven Lösung getränkt war, im Ultraschallfokus blieb, mussten sie in einem kleinen, speziell entwickelten Behälter kryokonserviert werden. Dieser Behälter bestand aus einer hohlen Vertiefung, die in eine Petrischale eingebaut war und für den Rest Agar als Füllmaterial verwendete. Sein Detail ist in Abb. 3d dargestellt. Die Abmessungen des Brunnens wurden auf 9 mm Durchmesser und 6 mm Tiefe festgelegt, was kleiner ist als die Abmessungen des fokalen Ovals. Um sicherzustellen, dass das Kryoschutzmedium nicht durch das Agar austritt, wurden die Wände der Vertiefung mit einem Film aus Isopropylalkohol bedeckt. Die Wirksamkeit der Behandlung wurde durch Permeabilitätsexperimente dieser Vertiefungen bestätigt, die durch den Durchgang – oder auch Nichtdurchgang – von Phenolrot als Färbung durch das Agar nachgewiesen wurden. Diese maßgefertigten Brunnen dienen lediglich als Einschlussbehälter, der an unsere Geometrie angepasst ist; Alternative Materialien und Formen können ebenfalls verwendet werden, sofern sie Ultraschall übertragen können. Abschließend wurden die Platten vor dem Abkühlen stets mit dem Deckel verschlossen und mit Parafilm versiegelt. Dies ermöglicht den GMP-gerechten Einsatz unserer Technologie, da die Probe isoliert wird. Für die Wiedererwärmung mit Ultraschall wurde Ethylenglykol als flüssiges Medium zur Übertragung der Schallwellen vom Schallkopf zur Probe gewählt. Dieses Medium kann Nematoden zunächst bei − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) halten, indem es auch bei ausreichend niedrigen Temperaturen in einem flüssigen Zustand bleibt.

Wärmegeschichte für die Kryokonservierung von C. elegans und Versuchsaufbau. (a) Temperaturkurven während des langsamen Gefrierprozesses, der Lagerung bei \(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) (dargestellt durch die „Lücke“ in der Grafik) und der Wiederherstellung durch HIFU-Erwärmung. Die Proben beginnen bei Raumtemperatur und werden nach 10-minütiger Inkubation in kryoprotektiver Lösung in den Gefrierschrank bei \(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) gestellt, um bei \(- 0,6 \; ^) abzukühlen \circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Anschließend werden sie 48 h gelagert und durch Ultraschallerwärmung direkt von der Lagertemperatur bis zu einer Temperatur von etwa \(-5 \; ^\circ{\rm C}\) wiederhergestellt. (b) Versuchsaufbau mit A: Ethylenglykolbad bei \(-70 \; ^\circ{\rm C}\); B: HIFU-Wandler; C: Plattenträger aus PLA; D: Petrischale (mit Vertiefung in der Mitte), abgedeckt, mit Parafilm versiegelt und umgedreht; E: Außenthermometer; F: Rechteckwellengenerator; G: externe Stromversorgung. (c) 3D-Schnittansicht des Versuchsaufbaus, modelliert in CAD. In diesem Bild kommt die Funktion der Stütze und ihre Verwendung besser zur Geltung. Die Tags werden mit dem Bild geteilt (b). (d) Detail der Agarvertiefung in einer Petrischale mit 50 mm Durchmesser. Die Platte wird umgedreht präsentiert, also auf dem 3D-Träger platziert, um dem Ultraschall ausgesetzt zu werden.

Das notwendige Eintauchen des HIFU-Wandlers mit seinem konkaven Teil in das Bad erzeugte häufig eine unerwünschte Luftblase. Diese wurden mittels eines in das Ethylenglykol getauchten Gassaugers beseitigt. Schließlich wurden die Wiederholbarkeit der Experimente und die Stabilität der Position des Fokus in Bezug auf die erhitzte Probe durch die Konstruktion eines 3D-gedruckten Trägers aus Polymilchsäure (PLA) gewährleistet, der die Petrischale und den Wandler sicher aufnimmt und fixiert. Hergestellt mit CAD- und FDM-Techniken. Abbildung 3b und c zeigen den Versuchsaufbau für den Einsatz von HIFU mit den hergestellten Platten. Einzelheiten zu den Fehlermodi und der Praktikabilität der Heizung finden Sie in den Zusatzinformationen.

Die physikalische Leistung des gesamten oben beschriebenen Aufbaus wurde rechnerisch unter Verwendung finiter Elemente (Comsol Multiphysics v6.7) modelliert, wobei die Pakete Akustik und Wärmeübertragung zusammen verwendet wurden. Das Ergebnis dieser Computersimulationen bestätigte sowohl die Position des Fokus und seine Abmessungen als auch die experimentell ermittelten Erwärmungsraten. Die Schalldruck- und Temperaturfelder in einer 2D-Ansicht des Experiments sind in Abb. 4e bzw. f dargestellt. Abbildung S10 bietet einen Überblick über die isothermen Konturen während einer 60-s-Erwärmungssimulation.

Präsentation der Ergebnisse. (a) Überleben mit HIFU entsprechend der Erwärmungsrate und der Expositionszeit. Niedrige Erwärmungsraten führen zu schlechteren Ergebnissen bei der Erholung von C. elegans. Die Experimente wurden immer mit Platten durchgeführt, die Gruppen von \(\sim 200\) Nematoden enthielten. Diese zeigten folgende durchschnittliche Zusammensetzung: 20 % Individuen im Stadium L1, 30 % im Stadium L2, 25 % im Stadium L3, 15 % im Stadium L4 und 10 % Erwachsene. Bei den optimalen Parametern war das Überleben nach Wachstumsstadien nicht homogen, da mehr L1–L3-Nematoden gewonnen wurden als L4- und adulte Nematoden. Die L4-Überlebensrate betrug 70 %. Die Überlebensrate der Erwachsenen lag zwischen 40 und 60 %. (b) und (c) Zeigen das Überleben für die höchsten Erwärmungsraten, \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) und \(217,8 \;^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) als Funktion der Belichtungszeit. Kurze (weniger als 50 s) und zu lange (mehr als 70 s) Expositionszeiten führten zu sehr niedrigen Überlebensraten. (d) Abhängigkeit von der Erwärmungsrate für die optimale Belichtungszeit. Bei niedrigen Erwärmungsraten liegt die Erholungsrate nahe bei 0 % und erreicht bei den höchsten Erwärmungsraten 90 %. Diese Ergebnisse müssen mit dem Brenner-Protokoll verglichen werden, mit nur 35 % für die günstigsten Stadien (L1–L2) und nahezu 0 % für Erwachsene. Die gestrichelte Linie ist keine Interpolation der Ergebnisse, sondern eine Trendlinie. (e) Finite-Elemente-Simulation des Schalldrucks in einem 2D-Abschnitt des Experiments. Der Bereich des höchsten Schalldrucks, 270 dB, wird im geometrischen Fokus des Wandlers erreicht. (f) Simulation durch finite Elemente des Temperaturfeldes. in einem 2D-Abschnitt des Experiments, nach 60 s HIFU-Exposition. Die höchste Temperatur wird im Fokus erreicht. Die Petrischale wird umgedreht aufgestellt, wobei das schwarze Rechteck die Vertiefung mit den Würmern darstellt, um einen Luftspalt zwischen den Ultraschallgeräten und den Nematoden zu vermeiden. (g) Abgestorbener Fadenwurm nach nicht ausreichend schneller Wiedererwärmung (\(<150 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)). (h) Nematoden einige Stunden nach ihrer Genesung durch HIFU-Erhitzen. Alle Wachstumsstadien werden geschätzt. (i) C. elegans-Ei nach der Erholung der Nematoden: Ihre Fortpflanzungsfähigkeit bleibt nach Kryokonservierung und HIFU-Wiedererwärmung erhalten.

Nachdem wir alle vorherigen Details und Überprüfungen geklärt hatten, gingen wir zur experimentellen Phase mit C. elegans über. Zu diesem Zweck wurden die Nematoden nach dem Standard-Brenner-Protokoll53 durch langsames Einfrieren in 15 % Glycerin kryokonserviert, angepasst an unsere Bedürfnisse. Populationen von etwa 200 Individuen aller Wachstumsstadien wurden bei −\(0,6 \; ^\circ{\rm C}/min\) auf − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) abgekühlt. in den Vertiefungen der oben beschriebenen Petrischalen. Die in diesem System gebildete Eismenge wird in den Zusatzinformationen erläutert. Nach 48 h Lagerung bei − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) wurden die Nematoden wieder erwärmt. Für jedes Experiment gab es immer zwei Teller. Die erste Platte wurde erneut mit Ultraschall erwärmt, wobei diese angewendet wurden, bis die Temperatur der Vertiefung mit den Nematoden etwa − \(5 \; ^\circ{\rm C}\) erreichte (Temperatur, die über dem Schmelzpunkt der Lösung liegt). Die Temperaturentwicklung während des Prozesses ist in Abb. 3a dargestellt. Die zweite Platte wurde auf die übliche Weise erneut erwärmt: entweder indem man sie an der Luft beließ (Erwärmungsrate: \(\sim 10 \; ^\circ{\rm C}\)/min), bis die Lösung mit den Nematoden vollständig aufgetaut war , oder durch Eintauchen in ein Wasserbad bei \(37 \; ^\circ{\rm C}\) (Erwärmungsrate: \(\sim 93 \; ^\circ{\rm C}\)/min) für 1 Minute. Nach dem Wiedererwärmen wurden die Würmer auf einen Teller mit Futter gelegt. Schließlich wurde die Erholung dieser Tiere beobachtet, indem ihre Mobilität unmittelbar nach der Ablage, ihre Mobilität nach 24 Stunden und ihre Reproduktionsfähigkeit analysiert wurden.

Insgesamt wurden 53 HIFU-Experimente mit mehr als 10.000 Nematoden durchgeführt. Die in Abb. 4a dargestellte Tabelle zeigt die Überlebensrate entsprechend der Erwärmungsrate und der Ultraschall-Expositionszeit. Alle Erwärmungsraten in Abb. 4 wurden im Intervall von − \(60\) bis − \(40 \; ^\circ{\rm C}\) gemessen. Dieses Intervall wurde gewählt, weil es die Zone ist, in der das Rekristallisationsproblem kritischer sein kann43,54.

Der Ultraschallwandler wurde mit vier verschiedenen Leistungen betrieben: 13,6 W, 33,9 W, 90,5 W und 134,4 W. Ein Teil dieser Energie ging in der Elektronik verloren. Die damit verbundenen Erwärmungsraten, gemessen mit Thermoelementen, betrugen \(14,2 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), \(31,7 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min }\), \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) bzw. \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Höhere Geschwindigkeiten konnten nicht erforscht werden, da letztere das mit unserem aktuellen System erreichbare Maximum darstellen.

Vor den unten dargestellten Ergebnissen wurde eine Reihe vorläufiger und explorativer Experimente durchgeführt, um den Nutzen hoher Erwärmungsraten zu belegen. Aus diesem Grund wurden später die höheren Erwärmungsraten genauer untersucht: \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) und \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Für sie wurde ein Spektrum an Belichtungszeiten untersucht: 30 s, 40 s, 50 s, 60 s, 70 s und 80 s für \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /min\) und 40 s, 50 s, 60 s, 70 s, 80 s und 90 s für \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abb. 4b und c dargestellt. In beiden Fällen wurde beobachtet, dass eine unzureichende oder übermäßige Exposition gegenüber HIFU für die untersuchte Bevölkerung tödlich war.

In Abb. 4b, entsprechend einer Erwärmungsrate von \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), können wir dies für Belichtungszeiten von weniger als 30 s, 40 s und 50 sehen s, die Wiederherstellungsrate beträgt 0 %. Sie steigt 60 s lang an, erreicht nach 70 s ein Maximum, fällt bei längeren Belichtungszeiten wieder ab und erreicht schließlich 0 % (nicht dargestellt).

In ähnlicher Weise beträgt die Erholungsrate in Abb. 4c, entsprechend einer Erwärmungsrate von \(217,8 \; ^\circ{\rm C}/\mathrm{min}\), für Expositionen von weniger als 40 s 0 %. Mit zunehmender Belichtungszeit auf 40 s, 50 s und 60 s nimmt die Erholungsrate allmählich zu und erreicht ein Maximum für 70 s. Ab diesem Wert für die Belichtungszeit sinkt die Erholungsrate wieder, bis sie Null wird.

Schließlich ist in Abb. 4d das Überleben gegen die Erwärmungsrate für zuvor gefundene optimale Expositionszeiten aufgetragen. Diese Grafik zeigt, wie die Überlebensrate bei den niedrigsten Erwärmungsraten bei praktisch 0 % beginnt, bei mittleren Erwärmungsraten (\(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)) auf 20 % ansteigt und erreicht schließlich 90 % für die höchsten Erwärmungsraten (\(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)).

Für Erwachsene gab es für die optimale Konfiguration \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) und eine Belichtungszeit von 70 s 3 Platten. In jedem von ihnen befanden sich, wie auch in den übrigen Platten dieser Studie, etwa 200 Würmer, von denen etwa 20 ausgewachsene Würmer waren. Nach der Ultraschallanwendung wurden im schlimmsten Fall 7 Erwachsene und im besten Fall 10 gefunden, was einer Überlebensrate zwischen 40 und 50 % für Erwachsene entspricht. Videos der erwachsenen geborgenen Würmer sind in den Zusatzinformationen zu sehen (Abb. S11). Bedenken Sie, dass die Erholungsrate bei Erwachsenen bei herkömmlicher langsamer Aufwärmphase nahe bei 0 % liegt.

Abbildung 4g–i zeigt jeweils ein Detail eines Nematoden, der durch eine unzureichende Erwärmungsrate getötet wurde, eine Gruppe von Nematoden jeden Alters nach Wiedererwärmung bei \(217,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\ ) während 70 s und ein kurz nach der Genesung der Nematoden gelegtes Ei.

Der Vollständigkeit halber sind die beiden Formen der Standarderwärmung, in einem Bad bei \(37 \; ^\circ{\rm C}\) und an der Luft (Raumtemperatur: \(25 \; ^\circ{\rm C}\) \)), wurden ebenfalls registriert. Im Wasserbad betrug die Überlebensrate 0 %, was mit Brenners Erkenntnissen übereinstimmt23 (siehe Ergänzende Informationen zur Diskussion dieses Ergebnisses). Bei der Luft betrug die Erholung für L1–L2 etwa 35 % und für Erwachsene nahezu 0 %, was ebenfalls mit unseren jüngsten Studien übereinstimmt51.

Wir können daraus schließen, dass diese Beobachtungen zum ersten Mal die Fähigkeit von HIFUs belegen, die erforderlichen Erwärmungsraten zu erreichen, um das Problem der Rekristallisation bei der Kryokonservierung zu vermeiden. Die Vorteile dieser Technologie sind vielfältig: (1) Sie erzeugt keine stationären Muster wie Mikrowellen, (2) es besteht nicht das Problem des thermischen Durchgehens, (3) sie kann für Proben verwendet werden, die bereits mit herkömmlichen Kryoschutzmitteln gelagert wurden, (4) es kann in Echtzeit durch MRT überwacht werden, (5) kann leicht durch Interferometrie kontrolliert werden, (6) wird routinemäßig in vielen anderen Bereichen eingesetzt, was einen großen Vorteil darstellt, und vor allem (7) ist skalierbar. All dies macht diesen Ansatz zu einem vielversprechenden Instrument, entweder allein oder in Verbindung mit anderen neuen Technologien wie der Nanoerwärmung39. Nächste mögliche Schritte sind die Skalierung der Anzahl der Wandler, der Einsatz in Verbindung mit der Röntgen-Computertomographie zur Überwachung des CPA-Feldes/Eis/Frakturen und die Anwendung auf Systeme, die bereits einen gewissen Erfolg gezeigt haben.

C. elegans wurde als Tiermodell verwendet. Wir glauben, dass es sich um ein ideales System mit einem vollständigen Satz an Organen handelt, das die Grundlage wichtiger Entwicklungen in der Genetik, Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaft oder Onkologie bildet und ein Arbeitsinstrument für mehr als 500 Labore auf der ganzen Welt ist. Die Verwendung des Wurms dient hier nur dem Beweis des Prinzips; Dennoch kann es per se für die Erhaltung des erwachsenen Zustands, für Stämme, die schlecht gefrieren, oder für Strukturen mit ähnlicher Größe wie der Drosophila-Embryo55 von Interesse sein. Auf jeden Fall hilft unsere Technik in allen Situationen, in denen das allgegenwärtige Problem der Rekristallisation auftreten kann, einschließlich der Kryokonservierung von Organen. Von der Anwendung in diesem Bereich erwarten wir einen Paradigmenwechsel und neue Wege hin zum Organ- und Gewebebanking.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde teilweise durch folgende Zuschüsse unterstützt: Plan Propio de Investigacion de la Universidad de Sevilla und Ministerium für Wissenschaft und Technologie (Spanien), AICIA, PEJUS-89 und EQC2019-005949. Wir danken Juan Jose Jimenez für seine Arbeit mit der Elektronik. Wir danken auch den anonymen Gutachtern, die zur Verbesserung der Qualität dieses Manuskripts beitragen.

Higher School of Engineering, C/Camino de los Descubrimientos s/n, Universität Sevilla, 41092, Sevilla, Spanien

Enrique Alcalá, Laura Encabo, Fatima Barroso, Adriana Puentes und Ramon Risco

SafePreservation, C/Avda. De la Ciencias 55, 41020, Sevilla, Spanien

Isabel Risco

National Accelerators Centre-US, JA, CSIC, C/Tomas Alva Edison 7, 41092, Sevilla, Spanien

Ramón Risco

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RR und IR entwickelten die Idee von HIFU, um eine Rekristallisation zu vermeiden; EA und LE führten den Kühlvorgang durch; EA und AP machten die Aufnahmen mit dem Ultraschall; LE und FB haben die Würmer gepflegt; EA hat die 3D-Designs erstellt; EA und AP haben den Schwerpunkt festgelegt; EA führte die Computersimulationen durch. LE und FB haben die Lösungen vorbereitet; EA und LE stellten die speziellen Agarplatten her; EA führte die statistische Analyse durch; EA, LE, IR und RR haben den Artikel geschrieben; EA, LE, IR und RR haben es kritisch gelesen; RR führte das Team an.

Korrespondenz mit Ramon Risco.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Ergänzende Abbildung 10.

Ergänzende Abbildung 11.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Alcalá, E., Encabo, L., Barroso, F. et al. Schallwellen zur Lösung des Problems der Rekristallisation bei der Kryokonservierung. Sci Rep 13, 7603 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

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Eingegangen: 20. Dezember 2022

Angenommen: 05. Mai 2023

Veröffentlicht: 10. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

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